TEME

Hromatografija na koloni

Hromatografija na koloni


Tamo hromatografija (iz grčkog χρῶμα, transliterat in khrôma, "boja"), je tehnika za razdvajanje komponenata homogene smjese na osnovu raspodjele njenih komponenata između dvije faze, jedne stacionarne i one koja se kreće duž određenog smjera. Inkolonska hromatografijasmjer ide od vrha prema dnu i diktira ga staklena cijev (stupac).

Tamo kolonska hromatografija je posebna hromatografska tehnika koja se temelji na svojstvu da neke tvari, nakon što se otope u prikladnim otopinama, djeluju u interakciji s prikladno pripremljenom čvrstom matricom. Pokušat ću bolje objasniti šta znači ono što sam upravo napisao!

Hromatografija na stupcu: što je to

To je ništa drugo do metoda kromatografskog odvajanja koja se odvija u staklenom stupcu. Ova tehnika iskorištava razliku u naboju, veličini, afinitetu veze ili drugim svojstvima komponente koja se izolira kako bi stvorila trake sa različitim karakteristikama.

Na fotografijama na ovoj stranici prikazujemo vam sekvencekolonska hromatografijaa posebno ekstrakcija eluata, odnosno "djelomično pročišćene" supstance koja izlazi iz završnog izljeva staklene kolone.

Tamokolonska hromatografijavrlo je korisno za pročišćavanje proteina i za odvajanje velikog broja supstanci koje se ispituju pojedinačno. Ponekad supstance izolovane sakolonska hromatografija gube svojstva koja su imali unutar smjese. Sve ovisi o tehnicikolonska hromatografijai od supstance koju želite pročistiti.

Hromatografija na stupcu: kako to radi

Staklena cijev ispunjena je poroznim čvrstim materijalom, definiranim kao "stacionarna faza". Stacionarna faza ima odgovarajuća hemijska svojstva izabrana na osnovu supstance koja se pročišćava / odvaja od smeše. Kolona se zatim puni puferskim rastvorom, takođe prikladno formulisanim. Rešenje međuspremnika naziva se "mobilna faza”I sadrži smjesu koju želite razdvojiti.

Smjesa koja se odvaja se rastvara umobilna faza. Tada dolazi mobilna fazaslojevitana vrhustupaci procijeđena krozstacionarna faza(čvrsta matrica). Na taj način, rješenje se širi dužstupaci formira kontinuirani pojas duž cijele stacionarne faze. Tvari koje se eluiraju (napuštaju) stupac imaju specifična svojstva na osnovu redoslijeda izbjegavanja.

Da bismo bolje razumjeli, uzmimo primjer pročišćavanja proteina, čak i ako mobilna faza može biti predstavljena bilo kojom smjesom. Imat ćemo pojedinačne proteine ​​koji se eluiraju iz stupac manje ili više brzo prema njihovim svojstvima.

Prema tipu stacionarne faze, imamo različite tehnikekolonska hromatografija, Koji:

  • Hromatografija sa jonskom izmjenom
  • Molekularna ekskluzijska hromatografija
  • Afinitetna hromatografija

Postoji i skuplja tehnika koja koristi visoki pritisak, naimetečna hromatografija pod visokim pritiskomili HPLC.

Hromatografija sa jonskom izmjenom

In jonoizmenjivačka hromatografijačvrsta matrica (stacionarna faza) bogata je pozitivnim ili negativnim nabojima. Podrazumijeva se da jejonoizmenjivačka hromatografijaiskorištava razlike u vrsti i intenzitetuneto električni nabojpri određenom pH.

U ovom slučaju,stacionarna fazaje sintetički polimer (smola) koji sadrži negativno nabijene skupine (o čemu i govorimokationski izmjenjivači) ili pozitivno nabijene grupe (o kojima govorimoanion scabers).

Vraćajući se na primjer pročišćavanja proteina, razlika u napunjenosti povezana je s prisustvom aminokiselina s određenim funkcionalnim skupinama. Afinitet svakog proteina za nabijene grupe odstupacto ovisi o pH koji zauzvrat utječe na stanje jonizacije funkcionalnih grupa sastavnih aminokiselina.

Inkolonska hromatografijarješenje koje se priprema za mobilnu fazu je kritično. U našem primjeru s proteinima, koncentracija soli i pH mogu stvoriti gradijent koji može pogodovati ekstruziji određenih proteina.

Jonska hromatografija: kationska izmjena

U slučaju jonska hromatografijas matricom kationske izmjene, čvrsti matriks ima negativno nabijene skupine pa će proteini s neto pozitivnim nabojem posljednji poteći iz kolone. Prvi spojevi koji su izašli izstupaconi će biti oni s jakim neto negativnim nabojem (odbijanjem od matrice), tada će izaći supstance s djelomičnim negativnim nabojem. Tvari koje se eluiraju kretat će se krozstupacsa brzinom koja ovisi o njihovom neto punjenju u otopini koja se koristi.

Molekularna ekskluzijska hromatografija

U tom se slučaju smjesa (mobilna faza) dodaje u jednomstupackoji sadrže apolimersa unakrsnim vezama i molekulima izizolirationi će biti odvojeni veličinom. Instinktivno se misli da će najmanji molekuli prvo izaći iz kolone, ali u stvarnosti je upravo suprotno.

Veći molekuli bit će prisiljeni preći najkraći put do kraja kolone. Difuzijom će manji molekuli moći slobodno prodrijeti u pore čvrste matrice, što će potrajati dulje da se eluiraju. Prvi prikupljeni eluat bit će onaj koji sadrži najveće molekule.

Afinitetna hromatografija na koloni

Ligand je prisutan u stacionarnoj fazi. Kako otopina koju treba odvojiti prolazi kroz kolonu, molekuli koji imaju afinitet za taj ligand formirat će specifičnu vezu. Supstance od interesa će se zadržati u prvoj ili posljednjoj frakciji prikupljenoj na osnovu vrste korištenog liganda.

Tečna hromatografija pod visokim pritiskom

Tehnikekolonska hromatografijaupravo opisani mogu imati diskretnu rezoluciju opsega. Razlog? Svaka supstanca ima tendenciju difuzije nakon određenog vremena.

Korištenjem pumpi visokog pritiska brzina se povećava, a vrijeme koje molekuli putuju kolonom smanjuje. U tom kontekstu potrebne su hromatografske matrice sposobne izdržati jake pritiske.

Smanjivanjem vremena prolaska kroz kolonu,tečna hromatografija pod visokim pritiskom(HPLC) ograničava širenje traka i uvelike poboljšava razlučivost sakupljenog eluata.


Video: DZIEŃ NA KOLONII Z MARYSIĄ Muszyna 2019 (Maj 2021).